Nesse mesmo ano ingressa no Instituto Bacteriológico Osvaldo Cruz, no Rio, que dirige a partir de 1917. Em 1905, enviado pelo médico Osvaldo Cruz a Santos, São Paulo, para deter uma epidemia de malária, descobre que a transmissão é feita por um mosquito. Com isso viabiliza o combate eficaz à doença.
Em 1907, ao chefiar a comissão de estudos e prevenção da malária em Minas Gerais, começa a pesquisar uma endemia de causa ignorada, mais tarde chamada de doença de Chagas.
Em 1909 identifica o agente causador da moléstia, um protozoário ao qual dá o nome de Trypanosoma cruzi, em homenagem a Osvaldo Cruz. Também encontra o inseto transmissor, o barbeiro. Suas investigações permitem o desenvolvimento de métodos para o tratamento e a erradicação dessas doenças, o que lhe traz reconhecimento internacional. Morre no Rio de Janeiro, com extensa obra publicada.