Quando o meio-irmão de Pizarro, Gonzalo, prepara uma expedição para explorar as regiões desconhecidas a leste do Equador, Orellana assume o posto de tenente. Em abril de 1541, é enviado à frente do grupo para garantir provisões para a expedição.
No comando de um brigue e de 50 soldados, chega à confluência dos rios Napo e Marañón, onde o grupo o convence da impossibilidade de voltar a se reunir a Gonzalo Pizarro. Assim, decide seguir pelo rio Amazonas, e alcança sua foz em agosto de 1542.
Dirige-se então à ilha de Trinidad, no Caribe, retornando dali para a Espanha. De volta à corte, conta histórias sobre tesouros de ouro e especiarias e do encontro com tribos lideradas por mulheres, como na lenda grega das Amazonas (de onde viria o nome dado ao rio).
Ganha o direito de explorar as terras, mas, por causa de disputas entre Portugal e Espanha pela posse do Novo Mundo, não conta com a ajuda oficial do reino espanhol. Na viagem de retorno ao Amazonas, perde navios e homens na travessia do Atlântico e morre quando sua embarcação afunda na foz do rio.