Em 1553, um novo governador-geral foi nomeado para o Brasil: Duarte da Costa. Este governante trouxe para a colônia outros jesuítas para o Brasil, destacando-se entre eles o padre José de Anchieta. Ao contrário do governos anterior, este foi, do ponto de vista dos interesses administrativos, particularmente tumultuado. Ocorreram desentendimentos com o bispo D. Sardinha, motivados pelas críticas que aquela autoridade religiosa fazia ao comportamento moral do jovem Álvaro Duarte da Costa, filho do governador. Durante o seu governo, os franceses tentaram se estabelecer no (hoje) Rio de Janeiro, fundado ali um povoamento que se chamou França Antártica. Contudo, foi nesse governo que os padres José de Anchieta e Manoel da Nóbrega fundaram o Colégio de São Paulo, em 25 de janeiro de 1554. Junto ao colégio formou-se a vila que deu origem à cidade de São Paulo.
A invasão francesa trouxe complicações para a Coroa lusitana, pois os franceses souberam como cativar os índios. Nicolau Durand de Villegaignon, sabendo que a escravidão do índio causava profunda revolta nos nativos, impediu que os colonos os explorasse, tendo conquistado dos silvícolas a amizade e estima e, ao mesmo tempo, o apoio na luta contra os portugueses.
No ano de 1558, chegou ao Brasil um novo governador-geral. Mem de Sá, homem rigoroso no trato da coisa pública, mas também descrito como violento matador de índios, veio com o propósito de restabelecer o completo domínio luso da Colônia. Em 1563, começou a arquitetar planos para atacar os franceses. Para tanto, enviaram os padres Anchieta e Nóbrega para negocias a paz com os índios Tamoios, aliados dos franceses, tendo esta sido celebrada em setembro daquele ano.
Em 1565, Mem de Sá recebeu importante ajuda na luta contra os franceses. O seu sobrinho Estácio de Sá chegou ao Brasil parar tentar acabar, de uma vez por todas, com a França Antártica. A sua primeira providencia foi fundar um pequeno povoado para abrigar suas tropas, entre os morros Cara de Cão e Pão de Açúcar. Nesse povoado, que deu origem a atual cidade do Rio de Janeiro, os portugueses organizavam suas estratégias contra o inimigo. Em 1567, as tropas portuguesas receberam novos reforços militares e ajuda de índios do cacique Araribóia, tendo expulsado definitivamente os franceses de do local Contudo, Estácio de Sá não conheceu a glória da vitória, pois foi ferido mortalmente por uma flecha envenenada, cerca de um mês antes do combate final.
Além de expulsar os franceses, procurou Mem de Sá conquistar o bom relacionamento entre a Igreja e o governo e resolver o problema de escassez de mão-de-obra para a agricultura, por meio da importação de escravos negros. Em 1570, pediu ao rei de Portugal para que enviasse ao Brasil um substituo, pois queria viver seus últimos dias em Portugal. Um novo governador, D. Luís de Vasconcelos, foi nomeado pelo rei, não chegou a tomar posse, pois a frota que o transportava foi atacada por corsários franceses, tendo sido mortos não só o futuro governante como o resto da tripulação. Assim, Mem de Sá continuou governando o Brasil por mais dois anos, aqui falecendo em 1572.
Com a morte de Mem de Sá, a Metrópole resolveu descentralizar a administração do Brasil, divindindo-o em dois centros: o do norte, com sede em Salvador e a cargo de Luís de Brito Almeida, que governou de 1573 a 1578. O do sul, tendo por sede o Rio de Janeiro, ficou sob a responsabilidade de Antonio Salema, que governou de 1574 a 1578. Contudo, o rei de Portugal entendeu que os resultado práticos da experiência não haviam sido proveitosos. Destate, resolveu tornar Salvador o único centro administrativo do governo do Brasil, sendo sido enviado Lourenço da Veiga para ser o novo governador-geral, que exerceu o cargo de 1581, ano da sua morte. Em 1580, por questões dinásticas, Portugal passou a ser governado pelo Rei da Espanha, Felipe II, tendo se tornado o Brasil parte do reino espanhol. Este domínio durou até 1640, quando D. João IV subiu ao trono português, inaugurando a dinastia de Bragança.