No entanto, é preterida em favor da amante do rei, Diana de Poitiers. Após a morte de Henrique II e de seu filho mais velho, Francisco II, Catarina obriga Diana a devolver as jóias da coroa, com as quais fora presenteada, e a se retirar da corte.
Sobe ao trono Carlos XI, ainda menor de idade, em 1560, e Catarina torna-se regente da França. Esforça-se por conter os conflitos religiosos que dividem o país, procurando manter imparcialidade em relação aos protestantes (ou huguenotes), liderados por Gaspar de Coligny, e aos católicos, liderados pela casa de Guise.
Durante as guerras civis, contudo, que começam em 1562, fica contra os huguenotes. Os confrontos entre os dois grupos são abrandados em 1570 com a instituição da liberdade de culto, mas dois anos mais tarde, no dia 24 de agosto, Coligny é executado e as tropas dos Guise matam 300 mil huguenotes, no episódio conhecido como Noite de São Bartolomeu.
Durante o período em que permanece no poder, até 1574, amplia o palácio do Louvre, constrói o palácio das Tulherias e aumenta o acervo da biblioteca de Paris. Morre em Blois em 15.