Com o fracasso das capitanias hereditárias, é nomeado para o governo geral da colônia, com sede na Bahia. Parte de Portugal em 1º de fevereiro de 1549, acompanhado por mil homens, entre colonos, 600 degredados e seis jesuítas liderados pelo padre Manuel da Nóbrega.
Traz consigo também longas instruções para garantir a posse territorial da nova terra, colonizá-la e organizar as rendas da Coroa portuguesa. Para cumprir esses objetivos, cria cargos como o de ouvidor (responsável pela justiça), o de capitão-mor (encarregado de vigiar a costa) e o de provedor-mor (responsável pelo controle da arrecadação e de seu crescimento).
Na Bahia, Tomé de Sousa funda a nova capital, Salvador, e manda construir casas cobertas de palha, cercadas por uma paliçada (depois substituída por uma muralha de taipa). Em 1550 ordena a inspeção das capitanias do sul, visitando-as pessoalmente três anos depois. Melhora as fortificações da costa, distribui terras e passa a administrar o comércio com os índios. De volta a Portugal em 1553, é nomeado provedor da Fazenda.