Dois anos depois emigra para o Brasil na comitiva de Duarte da Costa, segundo governador geral, com o intuito de catequizar os índios. Em 25 de janeiro de 1554 funda um colégio às margens dos rios Tamanduateí e Anhangabaú.
Aos poucos se forma em torno dele um povoado que Anchieta batiza de São Paulo. Enviado pelo padre Manuel da Nóbrega a São Vicente, aprende tupi e escreve Arte de Gramática da Língua Mais Usada na Costa do Brasil.
Ao lado das obras catequéticas escreve poesias marcadas pela visão de mundo medieval. Em 1563, durante os cinco meses em que é mantido como refém dos índios tamoios, escreve o poema em latim De Beata Virgine Dei Matre Maria e vários autos religiosos. Já doente, muda-se para o Espírito Santo, onde morre, aos 63 anos. Em 1980 é beatificado pelo papa João Paulo II.